多西環(huán)素快速檢測試劑盒

使用說明書

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物多西環(huán)素將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭多西環(huán)素抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物多西環(huán)素的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物多西環(huán)素的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.5ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

組織樣本（雞、鴨、豬肉/肝、蝦、魚、雞蛋）：

多西環(huán)素 ………………………………………………10ppb

牛奶、蜂蜜樣本：

多西環(huán)素……………………………………………… 20ppb

反應(yīng)率：

多西環(huán)素 ……………………………………………100%  

 樣本回收率：

組     織   …………………………………… 85%±20%

牛奶、蜂蜜  ………………………………  80%±20%

【試劑盒組成】

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶）1ppm

4、 酶標(biāo)記物 12ml…………………………紅色帽

5、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

8、 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

10、 2X 濃縮復(fù)溶液   50ml ·………………藍(lán)色帽 

【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮 吹儀、刻度移液管

微量移液器：單道 20μl～200μl、單道100μl～1000μl、多道 30～300 μl

試           劑： 甲醇、正己烷、Na₂HPO₄·12H₂O、NaOH

NaH₂PO₄·2H₂O、NaCl

【實驗前溶液配制】

配液1、20mM PBS緩沖液

       5.16g Na2HPO4*12H2O；0.87gNaH2PO4*2H2O;8.5gNaCl；

       加入蒸餾水至1000ml；用于樣品提取液的配制。

配液2、樣品提取液的配制

        取1ml甲醇與9ml的20mM PBS緩沖液混勻。

配液3、 將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按1：1稀釋。(1份濃縮復(fù)溶掖+1份去離子水，用于樣本提取后的復(fù)溶與稀釋)。

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19

               稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按 所需用量

               配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】

u 樣本處理前須知

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試

劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，

必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實

驗結(jié)果。

u 樣本處理：

（a）組織樣本前處理方法（不用過柱）

1、 稱取1±0.05g 均質(zhì)后的樣本于離心管中，加入4ml樣品提取

       液，振蕩5min，室溫4000r/min 以上，離心10min；

2、 取1ml上清液收集于另一試管中;加入1ml 正己烷,振蕩1min，

    室溫4000r/min 以上，離心10min；

3、 取50 µl下層液體于另一容器中，加入200μl樣本稀釋液混合

    30s；

4、 取50 μl 用于分析

    樣本稀釋倍數(shù): 20 倍

（b）蜂蜜處理方法

1、 準(zhǔn)確稱取1±0.05g 蜂蜜樣本于離心管中，加入4ml 樣品提 取

        液，強(qiáng)烈混合振蕩5min，室溫 4000r/min以上，離心10min；

2、 取出50μl 上清液于另一試管中，加入450μl樣本稀釋混合

    30s；

3、 取50 μl 用于分析

樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

（c）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶與1950μl樣本稀釋液，混30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環(huán)境3000r/min，離心

   10min；（如果沒有冷凍離心機(jī)請預(yù)先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于與1950μl樣本稀釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

   樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

【 酶標(biāo)免疫分析程序】

u 操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含多西環(huán)素的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

    用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1 的吸光度值為0.3，樣本2 的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb 為2.243； 0.5ppb 為1.816；1.5ppb 為1.415；4.5ppb 為0.74；1 3.5ppb 為0.313；40.5ppb 為0.155。則樣本1 的濃度范圍是13.5ppb～4.5ppb；樣本2的濃度范圍是0.15ppb～0.45ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中多西環(huán)素實際濃度。           

1、定量分析：

所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中多西環(huán)素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出多西環(huán)素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)多西環(huán)素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。