嘔吐毒素快速檢測試劑盒

使用說明書

【產品簡介】

  嘔吐毒素是一類真菌毒素，它具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關的產品中。其中嘔吐毒素的毒性、致癌性、污染頻率均居于首wei。薄層色譜一直是檢測嘔吐毒素常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時費時又費力。而使用嘔吐毒素 ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中嘔吐毒素殘留。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物嘔吐毒素和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭嘔吐毒素抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物嘔吐毒素的含量成負相關，與標準曲線比較可得出相應殘留物嘔吐毒素的含量。

【試劑盒技術指標】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 5ppb

檢測時間： 75min

樣本檢測下限：

牛奶……………………………………………50ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………5ppb

飼料、谷物、玉米、花生、豆類、果蔬……………500ppb

反應率：

嘔吐毒素……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

飼    料…………………………………………75±10%

【試劑盒組成】   

1.     微量測試孔：（1X96孔板）每條8孔，一板12條

2.   標準液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、5ppb、15ppb、45pp、135ppb、405ppb

3.    酶標記物       12ml…………………………紅色帽

4.    抗體工作液     7ml…………………………綠色帽

5.    底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

6.    底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

7.    終 止 液          7ml…………………………黃色帽

8.    20X濃縮洗滌液40ml…………………… 白色帽

9.  2X濃縮復溶液液50 ml………………… 藍色帽

【所用儀器、試劑】   

儀          器：微孔板酶標儀450nm/630nm、旋轉蒸發(fā)儀/

                     氮氣吹干裝置、均質器、振蕩器、離心機、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：甲醇、正己烷、濾紙

【實驗前溶液配制】

配液1、樣品提取液：70%甲醇溶液

        30ml蒸餾水或去離子水和70ml純甲醇混合制

         備70％甲醇溶液。

配液2、將2X濃縮復溶液液用去離子水按照1：1稀

             釋（1 份濃縮樣品液+1份去離子水）用于樣品的

             稀釋。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

              稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

              配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實驗之前須檢查實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

（a）生鮮牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+450µl復已稀釋好的溶液液混合30s；

     2、取50µl用于檢測檢測分析。

          樣本稀釋倍數:10

（b）奶粉、奶油、奶酪

1、稱取5g樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮氣/空氣吹干。

3、用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復溶液液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

4、取50ul下層溶液進行檢測分析。

     樣本稀釋倍數:1

（C）飼料、谷物、玉米、花生、豆類、果蔬

1、稱取2g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的提取溶液混合；強力振蕩5分鐘。

2、用Whatman No.濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與已稀釋好的復溶液液950ul 充分混合30s

      取50ul進行檢測分析。

          樣本稀釋倍數:100

【酶標免疫分析程序】

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應30min。

5、 取出將孔內液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 每孔加入酶標記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應30min。將孔內液體甩干，用洗滌液充分洗，4-5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、  顯色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內讀完數據）測定吸光度值（OD值）。

【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與嘔吐毒素的含量成負相關。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標準吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.610；5ppb為1.350；15ppb為1.030；45ppb為0.660； 135ppb為0.379；4050ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是135ppb-4050ppb； 樣本2的濃度范圍是15 ppb-45ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中嘔吐毒素的實際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以嘔吐毒素標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中嘔吐毒素實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

  5          15        45         135     405

嘔吐毒素(ppb) [µg/kg]

圖1：嘔吐毒素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

      0          5     15       45     135    405     

嘔吐毒素 (ppb) [µg/kg]

圖2：嘔吐毒素檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出嘔吐毒素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應嘔吐毒素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

  有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。