呋喃妥因代謝物ELISA檢測試劑盒

（尿樣專用）使用說明書

【產(chǎn)品簡介】

硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經(jīng)被廣泛應(yīng)用，作為禽類、水產(chǎn)和豬促生長的添加劑。呋喃妥因在1995年被禁用。由于硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物則能存留較長的一段時間，所以管理部門就以檢測代謝產(chǎn)物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。

呋喃妥因代謝物快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點，適用于動物尿液大批量樣品中的呋喃妥因代謝物快速檢測。

【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)和雞肉等組織樣本中的AHD，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應(yīng)的原理來進行的，樣本中的AHD和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的AHD含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出呋喃妥因代謝物含量。

【試劑盒技術(shù)指標】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

蜂蜜……………………………………… 0.3ppb

參考標準GB/T 21311-2007 檢測下限為0.5ppb

交叉反應(yīng)率：

呋喃妥因代謝物……………………………… 100%

呋喃西林代謝物………………………………﹤0.1%

呋喃它酮代謝物………………………………﹤0.1%

呋喃唑酮代謝物………………………………﹤0.1%

回收率：

組織、肝臟………………………………90%±15%

蜂蜜、牛奶、腸衣………………………80%±15%

【試劑盒組成】   

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標準液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、 高濃度標準品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、 酶標記物      7ml………………… 紅色帽

5、 抗體工作液  7ml………………… 藍色帽

6、 底物A液     7 ml………………… 棕色帽

7、 底物B液     7 ml ………………… 黑色帽

8、 終止液     　7 ml ………………… 黃色帽

9、 20×濃縮洗滌液40 ml…………… 白色帽

10、 2×濃縮復(fù)溶液 50 ml …………… 藍色帽

11、 衍生化試劑　 10ml ………………黑色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、 多道250µl

試          劑：*、乙酸乙酯、正己烷、磷酸氫二鉀、濃HCl

【實驗前溶液配制】

配液1、將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

配液3、 0.1MK₂HPO₄  稱11.4g K₂HPO₄·3H₂O

加去離子水溶解定容至500ml。

配液4、1M HCl溶液

取8.6ml濃HCl加去離子水定溶至100ml。

配液5、1M NaOH溶液

               取4g NaOH加去離子水定容至100ml。

【樣本前處理方法】   

樣本處理前須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、豬、牛、羊、兔、魚、蝦等。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（3）實驗前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟：

該方法為氯霉素和硝基呋喃類四項同時檢測的五合一前處理方法；用本方法制備出的樣品提取溶液可以直接同時應(yīng)用于本公司研發(fā)的氯霉素和呋喃唑酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物檢測試劑盒。(備注：使用該五合一前處理方法檢測氯霉素時，因存在一定的干擾；樣本檢測下限為0.3ppb）

(a) 尿樣（樣本稀釋倍數(shù)：1）

1. 尿樣必須收集新鮮清亮樣品（如尿樣渾濁可以進行過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣）存放在潔凈、干燥、不含防腐劑的容器內(nèi)備用。

2. 取3ml樣本于15ml離心管中，依次加入3ml去離子水，0.3ml 1M 鹽酸和0.2ml衍生化試劑，劇烈振蕩混勻1min；

3. 將上述15ml離心管在90℃水浴條件下孵育10分鐘；

4. 取出后依次加入，0.2ml 1M *,劇烈振蕩混勻30秒，再加入4ml乙酸乙酯，充分振蕩混勻1min，在室溫下（20-25℃）4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3min（備注：若無離心機設(shè)備，將離心管靜置30min以上使樣本溶液分層）；

5. 移取離心后的上層溶液2ml于5ml離心管中，60℃下氮氣/空氣吹干；

6. 向吹干的離心管中加入1ml正己烷，先將管壁殘余物完quan振蕩

溶解，然后加入1ml稀釋好的1×復(fù)溶液，在室溫下（20-25℃）

4000r/min以上離心5min。

7、取50µl下層用于分析。

【酶標免疫分析程序】

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出需要數(shù)量的微孔及框架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本 50µl/孔到各自的微孔中，加入酶標記物50µl/孔,然后加入抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙墊好后拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與AHD的含量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含AHD濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.239，樣品2的吸光度值為1.1270，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.821；0.05ppb為1.464；0.15ppb為1.163； 0.45ppb為0.677； 1.35ppb為0.297； 4.05ppb為0.104。則樣品1的濃度范圍1.35ppb-4.05ppb；樣品2的濃度范圍0.15ppb-0.45ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中AHD實際濃度。

2、定量判定：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以AHD標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中AHD實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

         0.05      0.15      0.45       1.35       4.05

AHD(ppb) [µg/kg]

圖1： 呋喃妥因代謝物檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

          0      0.05    0.15    0.45    1.35     4.05

                                         AHD(ppb) [µg/kg]

        圖2：呋喃妥因代謝物檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出呋喃妥因代謝物檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)呋喃妥因濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】  

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。