氟喹諾酮類快速檢測試劑盒

使用說明書

【原理】

       試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中的殘留物氟喹諾酮類和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗氟喹諾酮類抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留氟喹諾酮類的含量成負相關，與標準曲線比較即可得出相應殘留物氟喹諾酮類的含量。

【試劑盒技術指標】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度：0.5ppb

檢測時間： 45min

交叉反應率：

環(huán)丙沙星（CIF）…………………………100％

恩諾沙星（ENR）…………………………75%

氧氟沙星（OFL）………………………… 99％

奧索利酸（OXO）………………………116％

達氟沙星（DAN）…………………………65％

諾氟沙星（NOR）……………………… 198％

洛美沙星（LOM）……………………… 86％

培氟沙星（PEF）…………………………56％

沙拉沙星（Sarafloxacin）……………190％

依諾沙星（ENO）…………………………98％

氟喹酸（FLU）…………………………… 96％

麻保沙星（MAR）……………………… 110％

氨氟沙星（AMI）…………………………98％

那氟沙星（NAD）…………………………56％

樣本回收率：

組   織…………………………………80±15%

血   清…………………………………80±15%

蜂   蜜 ……………………………… 75±15%

氟喹諾酮類檢測下限分別為：

環(huán)丙沙星（CIF） 檢測下限…………………………0.5ppb

恩諾沙星（ENR）檢測下限……………………約1ppb

氧氟沙星（OFL）檢測下限………………………約0.5ppb

達氟沙星（DAN）檢測下限………………………約1ppb

諾氟沙星（NOR）檢測下限……………………約0.25 ppb

洛美沙星（LOM）檢測下限………………………約0.5ppb

培氟沙星 （PEF）檢測下限……………………約0.25ppb

沙拉沙星檢測下限………………………………約0.55ppb

依諾沙星（ENO）檢測下限………………………約0.5ppb

奧索利酸（OXO）檢測下限………………………約0.5ppb

氟喹酸　（FLU）檢測下限………………………約.5ppb

麻保沙星（MAR）檢測下限………………………約0.5ppb

氨氟沙星（AMI）檢測下限………………………約0.5ppb

那氟沙星（NAD）檢測下限………………………約1ppb

【試劑盒組成】  

1、 微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、 標準品溶液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb

3、 高濃度標準品：×1瓶：（1ml/瓶） 1ppm

4、 抗體工作液         7 ml …………………………… 綠色帽

5、 酶標記物             7 ml …………………………… 紅色帽

6、 底物A液             7ml………………………………棕色帽

7、 底物B液　         7ml………………………………黑色帽

8、 終止液                  7ml………………………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml ……………………………白色帽

10、 2X濃縮復溶液    50 ml ……………………………藍色帽

【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試         劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉

                    Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【實驗前溶液配制】

配液1、0.1M HCL溶液  

860µl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。

配液2、乙腈-0.1MHCL溶液

V_乙腈：V_{0.1M –HCL} ＝ 84：16

配液3、乙腈-二氯甲烷混合溶液

V_乙腈-V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液4、pH7.2 0.05M PB緩沖液

12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O

            加去離子水1L溶解。

配液5、pH7.2  0.02MPB緩沖液

5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87g NaH₂PO₄·2H₂O

加去離子水1L溶解。

配液6、用去離子水將2X濃縮復溶液按1：1稀釋

（1份濃縮復溶液+1份去離子水）用于樣本復溶。

配液7：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

              稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

              配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】  

樣本前處理須知    處理任何樣本時，都必須注意：

（1）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、禽類和水產組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦、蛋類等。

（2）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同試劑時要更換吸頭。

（3）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結果。

（a）組織/蛋類樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚、蛋類等）

1、 稱2.0±0.05g 均質樣本于50ml離心管中；

2、 加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 取4ml清澈有機相至干燥溶器中，56℃氮氣吹干/旋轉蒸發(fā)至干；

4、 用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、 去除上層取下層50µl液體用于分析。

        樣本稀釋倍數：1

（b） 組織/蛋類低檢測限處理方法二

1、稱取2.0±0.05g均質過的組織樣本于50ml離心管中；加入4ml 0.02M  PB緩沖液，充分振蕩2min，于15℃，4000r/min以上速度離心10min

2、取50µl液體與450µl稀釋后的復溶液

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數：20倍

（c）血清樣本的處理

1、 用加有肝素鈉（20-30單位/ml血）的離心管采集血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿后4000r/min以上，15℃離心10min，取出血漿1ml；

2、 加入乙腈（無水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 移上清至另一離心管中，加入2ml 0.02M PB緩沖液，混勻；

4、 加入二氯甲烷5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去上層，取下層有機相到干燥瓶中（清亮無雜質），50℃旋轉蒸發(fā)至干/氮氣吹干；

5、 用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

6、 輕吸掉上層和中間白色雜質，取下層相100µl加入100µl稀釋后的復溶液，混合30s；

7、 取50µl用于分析。

       樣本稀釋倍數：2

（d）蜂蜜高檢測限發(fā)法方法

1、 取1g蜂蜜，加６ml乙腈-0.1MHCL溶液振蕩至蜂蜜全部溶解；

2、 加入３ml 0.05M PB緩沖液，加入11ml二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min以上離心5min；

3、 輕吸掉上層，取下層有機相８ml至干燥溶器中，56℃氮氣吹干；

4、 用1ml稀釋后的復溶液溶解干燥的殘留物，再加入正己烷1ml混合30s，3000r/min以上，15℃離心5min；

5、 去除上層取下層50µl液體用于分析。

       稀釋倍數：2

（e）蜂蜜低檢測限發(fā)法方法

1、 稱取2±0.05g蜂蜜樣本于50ml離心管中，加入4ml 0.02M  PB緩沖液充分振蕩2min，；

2、 取50µl與950µl已稀釋好的復溶液復溶，混合30s；

3、 取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數：40倍

（f）牛奶

1、取出50μl 牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀釋液混30s；

2、取50µl液體用于分析。

樣本稀釋倍數：40倍

【酶標免疫分析程序】  

操作步驟：

1、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。

3、 編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品均需做2孔平行，并記錄標準孔的樣本孔所在的位置。

4、 加標準品/樣本50µl /孔，然后加酶標記物50μl/孔,再加入50µl/孔抗體工作液。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應30min。

5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內讀完數據），測定吸光度值（OD值）。

【結果判定】  

     結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與氟喹諾酮類的含量成負相關。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標準品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.845；0.5ppb為1.542；1.5ppb為1.130； 4.5ppb為0.635；13.5ppb為0.326； 40.5ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是13.5ppb-40.5ppb；樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb。乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氟喹諾酮類的實際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

（2）標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以氟喹諾酮類標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氟喹諾酮類的實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

3、標準準曲線：

B/B0 (%)

          0.5                1.5                  4.5                  13.5                40.5

(ppb) [µg/kg]

圖1：氟喹諾酮檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現性：

%CV

        0       0.5      1.5      4.5     13.5     40.5

(ppb) [µg/kg]

圖2：氟喹諾酮檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結果確定了精密度，圖2顯示出喹諾酮檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數（%CV）對相應喹諾酮濃度作曲線，可以看到在全部范圍內變異系數如此之低，可以得到很好的再現性。

【注意事項】  

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會伴隨著出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現重復性不好的現象。

4、 反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質。

8、 該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產日期、有效期、生產批號見外包裝。