黃曲霉毒素M1快速檢測(cè)試劑盒

使用說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品簡(jiǎn)介】

黃曲霉毒素是一類(lèi)真菌（如黃曲霉和寄生曲霉）的有毒的代謝產(chǎn)物，它們具有很強(qiáng)的致癌性，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽以及一些和人類(lèi)血液，動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中。其中黃曲霉毒素M1（AFM1）的毒性、致癌性、污染頻率均居于首wei。薄層色譜一直是檢測(cè)黃曲霉毒素常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時(shí)費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。而使用黃曲霉毒素M1 ELISA試劑盒則能夠快速而準(zhǔn)確的分析樣品中黃曲霉毒素M1殘留。參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.22-2003。

【測(cè)定原理】

本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物黃曲霉毒素M1和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)黃曲霉毒素M1抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物黃曲霉毒素M1的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物黃曲霉毒素M1的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.025ppb

檢測(cè)時(shí)間： 45min

樣本檢測(cè)下限：

牛奶……………………………………………0.25ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………0.025ppb

飼料……………………………………………2.5ppb

反應(yīng)率：

黃曲霉毒素M1……………………………………100%

回收率：

食    品…………………………………………85±10%

飼    料…………………………………………75±10%

【試劑盒組成】   

1、 微量測(cè)試孔：（1X96孔板）每條8孔，一板12條

1、 標(biāo)準(zhǔn)液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb

2、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶） 10ppb

2、 酶標(biāo)記物      7ml…………………………紅色帽

3、 抗體工作液     7ml…………………………綠色帽

4、 底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

5、 底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

6、 終 止 液          7ml…………………………黃色帽

7、 20X濃縮洗滌液40ml…………………… 白色帽

8、 2X濃縮復(fù)溶液50 ml…………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】   

儀          器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/

                     氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、

                     刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：?jiǎn)蔚?/span> 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：甲醇、正己烷、濾紙

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、50%甲醇溶液：

 50ml蒸餾水或去離子水和50ml純甲醇混合制備50％甲醇

溶液。

配液2、將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋?zhuān)?/span>1份濃縮復(fù)

溶液+1份去離子水）用于樣品的稀釋。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19

稀釋?zhuān)?/span>1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量

配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】   

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（1）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭

（2）實(shí)驗(yàn)之前須檢查實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a）生鮮牛奶；

     1、直接取50µl牛奶+450µl已經(jīng)稀釋后的復(fù)溶液混合30s；

     2、取50µl用于檢測(cè)檢測(cè)分析。

          樣本稀釋倍數(shù):10

（b）奶粉、奶油、奶酪

1、稱(chēng)取5g樣品于50ml離心管中，加入10ml甲醇，強(qiáng)力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮?dú)?/span>/空氣吹干。

3、用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml已經(jīng)稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

4、取50ul下層溶液進(jìn)行檢測(cè)分析。

     樣本稀釋倍數(shù):1

（C）飼料

1、稱(chēng)取2g粉碎的樣品于50ml離心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；強(qiáng)力振蕩5分鐘。

2、用Whatman No.濾紙過(guò)濾；收集過(guò)濾液。

3、取出上清液50ul與已經(jīng)稀釋后的復(fù)溶液950ul 充分混合30s

      取50ul進(jìn)行檢測(cè)分析。

          樣本稀釋倍數(shù):100

【酶標(biāo)免疫分析程序】

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、  顯色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、 測(cè)定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）測(cè)定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與黃曲霉毒素M1的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出樣本所含M1濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.248，樣品2的吸光度值為1.021，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.821；0.025ppb為1.434；0.075ppb為1.163； 0.225ppb為0.767； 0.675ppb為0.298； 2.025ppb為0.106。則樣品1的濃度范圍0.675ppb-2.025ppb；樣品2的濃度范圍0.075ppb-0.0.225ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素M1的實(shí)際含量。

2、定量判定：

所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以黃曲霉毒素M1標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉毒素M1實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

       0.025     0.075       0.225     0.675     2.025

                    黃曲霉毒素M1(ppb) [µg/kg]

圖1：黃曲霉毒素M1檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

         0      0.025    0.075     0.225   0.675   2.025

黃曲霉毒素M1 (ppb) [µg/kg]

圖2：黃曲霉毒素M1檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出黃曲霉毒素M1檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)黃曲霉毒素M1濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、批號(hào)見(jiàn)外包裝。