伏馬毒素快速檢測試劑盒

使用說明書

【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物伏馬毒素與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭其抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含伏馬毒素的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物伏馬毒素的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.5ppb

檢測時間： 75min

樣本檢測下限：

飼    料（谷物、豆類）…………………………50ppb

食用油…………………………………………12.5ppb

樣本回收率

飼    料（谷物、豆類）……………………80% ±10%

食用油………………………………………80% ±10%

試 劑 盒 組 成

1、微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、標(biāo) 準(zhǔn) 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、 0.5ppb、

     1.5ppb、4.5ppb、 13.5ppb、 40.5ppb

3、酶標(biāo)記物     12ml  …………………………… 紅色帽

4、抗體工作液 7ml ………………………………綠色帽

5、底物A液    7ml ………………………………棕色帽

6、底物B液　7 ml………………………………黑色帽

7、終止液        7 ml ………………………………黃色帽

8、2X濃縮復(fù)溶液 50 ml…………………………藍色帽

9、20X濃縮洗滌液40 ml………………………白色帽

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多 道250µl，WhatmanＮｏ１或相當(dāng)?shù)臑V紙

     試         劑：甲醇

【樣本前處理步驟】   

樣本前處理須知

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）標(biāo)準(zhǔn)液含有伏馬毒素毒素，應(yīng)特別小心，使用過的玻璃容器及伏馬毒素溶液最好用pH=7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡過夜。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理需配制：

配液1、50%甲醇溶液：

        50ml蒸餾水或去離子水和50ml純甲醇混合制

         備50％甲醇溶液。

配液2、樣本復(fù)溶液：

           將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水以1：1稀釋（1

          份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水），用于樣本提取

          后的復(fù)溶。

（a ）飼料（谷物、豆類）

1、稱取2g粉碎的有代表性的樣品于離心管中，加入10ml 50%甲醇溶液混合；強力振蕩3分鐘。

2、用Whatman No.濾紙過濾；收集過濾液。

3、取出上清液50ul與樣本稀釋液950ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

        樣本稀釋倍數(shù):100

(b)食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等)

1、稱取1g油樣品于10ml離心管中，先加入2ml 正己烷，再加入5ml的50%甲醇溶液混合；強力振蕩5min；室溫4000r/min以上，離心10min。

2、取下層溶液50ul與稀釋后的復(fù)溶液200ul 充分混合30s

      取50ul進行分析。

     樣本稀釋倍數(shù):25

【酶標(biāo)免疫分析程序】   

測定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫

     （20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃環(huán)境。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板

     的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的

     要點。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜

      封住微孔板。

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕震蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次間隔15-30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、  顯色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

9、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）測定吸光度值（OD值）。

  【結(jié)果判定】   

        結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法， 定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與伏馬毒素的含量成負相關(guān)。

1、 粗略判定

      用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值0.241，樣本2的吸光度值為0.785，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.260；0.5ppb為1.640；1.5ppb為1.234；4.5ppb為0.680； 13.5ppb為0.348；40.5ppb為0.125。則樣本1的濃度范圍是13.5ppb-40.5ppb；樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中伏馬毒素實際含量。

2、 定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以伏馬毒素濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中伏馬毒素實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

3、 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

       0.5               1.5             4.5             13.5           40.5

 (ppb) [µg/kg]

圖1：伏馬毒素檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

 %CV

      0        0.5     1.5     4.5    13.5    40.5 

(ppb) [µg/kg]

圖2：伏馬毒素檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出伏馬毒素檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)伏馬毒素濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。