托曲珠利快速檢測試劑盒說明書

【原理】

   本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物托曲珠利與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭其抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含托曲珠利的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物托曲珠利的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】   

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.5ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

動物組織、禽蛋………………………1ppb

牛     奶………………………………20ppb

樣本回收率

動物組織、禽蛋、……………………85±15%

牛          奶………………………85±10%

交叉反應(yīng)率：

托曲珠利 ………………………  100%

【試 劑 盒 組 成】 

1、微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、標(biāo) 準(zhǔn) 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、 0.5ppb、

     1ppb、2ppb、 4ppb、 8ppb

3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品×1瓶：（1ml/瓶）100ppb

4、酶標(biāo)記物     7ml  ……………………………   紅色帽

5、抗體工作液 7ml ……………………………… 綠色帽

6、底物A液    7ml ………………………………棕色帽

7、底物B液　7 ml………………………………黑色帽

8、終止液        7 ml ………………………………黃色帽

9、2X濃縮復(fù)溶液 50 ml…………………………藍色帽

10、20X濃縮洗滌液40 ml……………………… 白色帽

11、使用說明書………………… …………………1份

【所用儀器、試劑】   

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl，多道250µl

試         劑：、正己烷、乙腈、氯化鈉

【實驗前溶液配制】

樣本處理前需配制：

配液1、1×復(fù)溶液：

                將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水以1：1稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水），用于樣本提取和稀釋。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理方法】   

樣本前處理須知：處理任何樣本時，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測的組織樣本包括：動物組織、

禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同的試劑時要更換吸頭

（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

樣本前處理步驟

（a） 動物組織、禽蛋、泥土樣本處理方法

1、 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本；稱取3±0.05g樣本于50ml離心管中，加入1g氯化鈉，再加入6ml乙腈，用振蕩器振蕩5分鐘；4000轉(zhuǎn)/分以上,室溫離心5分鐘；

2、 取上清液2ml至干凈玻璃試管中，于65℃水浴下氮氣/空氣吹干；

3、 加入1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml配好的1×復(fù)溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。

4、 取50 µl下層清亮液體用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）牛奶樣本的處理方法（檢測限6ppb）

1、 取50 µl樣本+950 µl配制好的1×復(fù)溶液混合均勻。

2、 取50µl用于分析。

稀釋倍數(shù)：20   

【酶標(biāo)免疫分析程序】   

操作步驟：

1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境避光反應(yīng)30分鐘。

5、 洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加洗滌液 250µl/孔，每次浸泡15~30秒，充分洗滌4－5次，用吸水紙拍干。

6、 顯色：每孔先各加入底物液A 50μl，再各加入底物液B 50μl，輕輕晃蕩混勻，并在25℃下避光反應(yīng)15分鐘。

7、 讀數(shù)：每孔各加50μl終止液，在酶標(biāo)儀于450nm處測定OD值（建議用450/630nm雙波長檢測，在5分鐘內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）。

【結(jié)果判定】   

       結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與托曲珠利的含量成負相關(guān)。

1、 粗略判定

      用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值0.241，樣本2的吸光度值為0.785，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.890；0.5ppb為1.504；1.ppb為1.034；2ppb為0.580； 4ppb為0.348；8ppb為0.165。則樣本1的濃度范圍是4ppb-8ppb；樣本2的濃度范圍是1.ppb-2ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中托曲珠利實際含量。

2、 定量分析

（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以托曲珠利濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中托曲珠利實際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

3、 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

           0.5                1                    2                    4                    8

 (ppb) [µg/kg]

圖1：托曲珠利檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

 %CV 

0     0.5       1       2       4       8

(ppb) [µg/kg]

圖2：托曲珠利檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出托曲珠利檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)托曲珠利濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】   

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。