硝基咪唑類藥物快速檢測試劑盒

使用說明書

【原理】

本試劑盒是利用競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被抗 硝基咪唑類藥物抗原。檢測時(shí)，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液，硝基咪唑類藥物抗體及酶標(biāo)記物，包被抗原和加入樣本中的硝基咪唑類藥物競爭性地與硝基咪唑類藥物抗體結(jié)合后，再與酶標(biāo)記物形成抗原抗體復(fù)合物，用TMB底物顯色；加入反應(yīng)終止液，在450nm波長酶標(biāo)儀下進(jìn)行檢測，樣品中的硝基咪唑類藥物濃度與吸收光強(qiáng)度成反比。

【適用范圍】

本試劑盒是應(yīng)用ELISA技術(shù)研發(fā)的藥物殘留檢測產(chǎn)品,與儀器分析技術(shù)比較，能經(jīng)濟(jì)、快速地檢測出肌肉、肝臟等中的硝基咪唑類藥物類藥物。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度：1ppb

檢測時(shí)間： 75min

樣本檢測下限：

組織、蜂蜜………………………………………… 3ppb

牛奶………………………………………………… 40ppb

樣本回收率

組織、蜂蜜……………………………………80% ±10%

牛奶……………………………………………85% ±10%

交叉反應(yīng)率

甲硝唑………………………………………………100%

替硝唑………………………………………………90%

奧硝唑………………………………………………80%

塞克硝唑……………………………………………65%

【試劑盒組成】  

1、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、 標(biāo)準(zhǔn)品溶液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、 高濃度標(biāo)準(zhǔn)品：×1瓶：（1ml/瓶）1ppm

4、 酶標(biāo)記物       12ml………………………紅色帽

5、 抗體工作液   7ml ………………………綠色帽

6、 底物A液      7ml ………………………棕色帽

7、 底物B液     7ml  ……………………黑色帽

8、 終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

9、 20X濃縮洗滌液40 ml  ………………白色帽

10、 2X 濃縮復(fù)溶液   50ml ·………………藍(lán)色帽

【所用儀器、試劑】  

儀          器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、 刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl

試           劑：乙酸乙酯、NaOH、正己烷

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、0.1M氫氧化NA溶液

         稱0.4gNaOH加去離子水混勻溶解，定容至100ml

配液2、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)

溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液3、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19

稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離水）; 或按所需用量配制

洗滌液

【樣本前處理步驟】  

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（1）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（2）實(shí)驗(yàn)之前須檢查實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a ）動(dòng)物組織、蜂蜜

1、稱2.0±0.05g 均質(zhì)過的樣本于50ml離心管中；

2、加入3ml 0.1M氫氧化NA溶液，充分混勻1分鐘

3、加入4 ml乙酸乙酯充分振蕩5分鐘，室溫4000r/min，離心10分鐘；

4、取2ml清澈上層有機(jī)相至干凈玻璃試管中，56℃水浴氮?dú)?/span>/空氣吹干；

5、加1ml正已烷振蕩30秒，再加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒；室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；

6、去除上層有機(jī)相，取下層50µl液體用于分析

     樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）牛奶樣品處理方法

脫脂牛奶

1、取出50μl 脫脂牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀

  釋液，混合30s；

2、取50 μl 用于分析

脂肪奶

3、確吸取1ml 牛奶樣本于離心管中；于15℃環(huán)境

3000r/min，離心10min；（如果沒有冷凍離心機(jī)請預(yù)

先冷卻后再離心)

4、取出50μl 牛奶于另一試管中，加入1950μl樣本稀

  釋液，混合30s；

5、取50 μl 用于分析

  樣本稀釋倍數(shù): 40 倍

【酶標(biāo)免疫分析程序】  

操作步驟：

1、 從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置

4、 加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗體50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、 取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250µl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。重復(fù)步驟6。

7、 顯色：每孔加入底物液A液50µl， 再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

8、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定每孔吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】  

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含硝基咪唑類藥物成負(fù)相關(guān)

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.610；1ppb為1.350；3ppb為1.030；9ppb為0.720； 27ppb為0.359；81ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是27ppb-81ppb； 樣本2的濃度范圍是3 ppb-9 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中硝基咪唑類藥物實(shí)際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以硝基咪唑類藥物濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中硝基咪唑類藥物實(shí)際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>  

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

B/B0 (%)

3、標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

                  1                   3                    9                    27                  81    

       硝基咪唑類藥物(ppb) [µg/kg]

圖1：硝基咪唑類藥物檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

      0        1       3       9        27      81

硝基咪唑類藥物(ppb) [µg/kg]

圖2：硝基咪唑類藥物檢測試劑盒的精密度

 由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出硝基咪唑類藥物檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)硝基咪唑類藥物濃度作曲線，可以看到全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】  

1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

有效期12個(gè)月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。